Acte I

Don Pasquale, un célibataire septuagénaire, trépigne d'impatience dans sa demeure romaine, devant le retard de son convive. Arrive alors enfin le docteur Malatesta, qui lui annonce, par ruse, qu'il lui a trouvé une épouse : une femme douée de toutes les qualités qui se trouve être sa propre sœur (« Bella siccome un angelo »). Don Pasquale exulte et le presse de la lui présenter (« È mia sorella »), certain que l'amour lui fera retrouver la jeunesse et imaginant ses enfants courir autour de lui (« Ah ! Un foco insolito »).

Il se précipite alors pour annoncer la nouvelle de son mariage prochain à son neveu, Ernesto, qu'il cherche à marier à une femme riche et de bonne famille. Alors que celui-ci, amoureux d'une femme sans le sou, Norina, refuse un tel mariage, il espère le convaincre par cette annonce, de lui obéir. En effet, si Don Pasquale se marie et donne naissance à une descendance, l'héritage convoité échappera à Ernesto. Mais celui-ci reste narquois et met en doute cette annonce (« Prender moglie ? »). Mais il finit comprendre que son oncle est sérieux, et envisage d'accepter son chantage, ce qui réjouit Don Pasquale (« Sogno soave e casto »). Il perd même tout espoir en apprenant que c'est le docteur Malatesta, qu'il croyait son ami, qui a conseillé ce mariage à son oncle (« Ah! Mi Fa Il Destin Mendico »).

Dans sa chambre, Norina lit un roman dans lequel un héro fidèle s'agenouille aux pieds de sa belle. Elle en rit, sachant également comment mettre les hommes à ses pieds, d'un sourire ou d'un soupir. Elle se décrit volontiers comme une femme joviale, impulsive et capricieuse (« So anch'io la virtù magica »). Alors qu'on lui apporte une lettre d'Ernesto dans laquelle il se dit obligé de renoncer à elle, le docteur Malatesta paraît et la rassure en lui expliquant son plan pour faire céder Don Pasquale. Norina accepte de jouer le rôle de la sœur de Malatesta, Don Pasquale ne l'ayant jamais vue, et de lui faire renoncer à toute idée de mariage (« Pronta Io Son »). Après une courte répétition (« Mi Volete Fiera »), Norina se déclare prête à piéger Don Pasquale (« Vado, Carro »).

Acte II

Chez Don Pasquale, Ernesto se prépare à quitter la demeure de son oncle et à s'exiler pour une terre lointaine. Il pense à Norina qu'il laisse derrière lui, souhaitant qu'elle puisse être heureuse, quand bien même elle le serait avec un autre homme (« E Se Fia Che Ad Altro Oggeto »). Arrive alors Malatesta avec Norina déguisée et cachée sous un voile, qui se fait passer pour la sœur Sofronia. Celle-ci, jouant la timidité, feint d'oser à peine entrer dans la demeure. Elle rit pourtant d'avance de la farce qu'elle va jouer à un Don Pasquale déjà sous son charme (« Via, da brava »).

Interrogée sur ses goûts, elle déclare ne pas aimer la compagnie, habituée à être seule, aimer coudre et faire la cuisine, et n'étant jamais allée au théâtre. Cela enchante Don Pasquale, qui voudrait voir son visage. Sofronia (c'est-à-dire Norina déguisée) enlève son voile. Devant sa beauté, Don Pasquale est conquis et demande quand le mariage peut avoir lieu. Malatesta lui indique avoir amené son propre notaire pour le servir.

Le contrat est aussitôt dressé par le faux notaire. Don Pasquale décide de céder immédiatement la moitié de ses biens à sa nouvelle épouse (« Fra Da Un Parte Ectetera »). Entre alors Ernesto qui vient dire au revoir à son oncle, au grand dam de Malatesta qui n'a pas pu le prévenir de la machination. Don Pasquale invite son neveu à être témoin du mariage. Celui-ci reconnait aussitôt Norina, mais Malatesta parvient à le rassurer avant qu'il ne fasse échouer le plan (« Pria Di Partir, Signore »).

Chacun signe le contrat de mariage, et aussitôt, Sofronia se transforme, devenant impertinente et décidant de tout régenter. Elle invite d'ailleurs Ernesto à rester, ayant besoin de quelqu'un pour s'occuper d'elle (« Sieta Marito E Moglie »). Don Pasquale en reste pétrifié (« Ah! E' Rimasto Là Impietrato »). Elle appelle les domestiques et annonce qu'elle double leur salaire et multiplie leur nombre. Elle prévoit l'achat de deux nouvelles voitures, ainsi que de nombreux travaux dans la maison (« Riunita Immantinente »). Don Pasquale réalise alors qu'il a été trompé (« Io? Io? »).

Acte III

Les domestiques et prestataires s'affairent pour satisfaire les volontés de Sofronia, laissant au passage leurs factures à Don Pasquale (« I Diamanti, Presto, Presto »). Alors que Sofronia s'apprête à sortir au théâtre, couverte de diamants, Don Pasquale lui interdit la sortie et reçoit un soufflet qui le laisse interdit, désespéré. Sofronia lui conseille alors, étant donné son âge, d'aller se coucher en attendant son retour le lendemain matin. Don Pasquale songe alors au divorce (« Via Caro Sposino »). Sofronia quitte la demeure, feignant de laisser derrière elle un message de son amant, lui donnant rendez-vous le soir venu dans le jardin. Don Pasquale enrage et fait appeler son docteur, Malatesta.

Pendant ce temps, les domestiques vont et viennent, se moquant de la mésaventure de Don Pasquale (« Che Interminabile Andirivieni »). Malatesta adresse ses dernières recommandations à Ernesto avant de rejoindre Don Pasquale. Celui-ci regrette déjà sa querelle avec Ernesto. Il explique la situation à Malatesta qui feint de ne pas le croire. Don Pasquale lui montre alors la lettre. Tous deux décident de se cacher dans le jardin afin de surprendre les amants. Don Pasquale pourra ainsi obtenir son divorce (« Cheti, Cheti Immantinente ») : il rit d'avance de sa vengeance (« Aspetta, Aspetta »).

Dans le jardin, Ernesto chante une sérénade à Sofronia pour signaler sa présence (« Com' È Gentil »). Sofronia paraît et les deux amants chantent leur amour (« Tornami A Dir »). Alors que Don Pasquale arrive pour les surprendre, Ernesto s'enfuit. Trouvée seule, Sofronia nie avoir vu son amant et affirme être simplement venue prendre l'air. Don Pasquale enrage mais Malatesta lui promet de trouver une solution. Il annonce à Sofronia qu'Ernesto va se marier à Norina et que les deux femmes vont devoir cohabiter. Sofronia, feignant le dédain pour Norina, refuse catégoriquement et dit préférer quitter elle-même la demeure si tel devait être le cas. Exaspéré et ne souhaitant que mettre la jeune femme dehors, Don Pasquale assure qu'en effet, il accepte le mariage d'Ernesto et Norina. Malatesta révèle la manigance, Don Pasquale comprend que Sofronia et Norina ne forment qu'une, mais il finit par pardonner à tout le monde et par bénir le mariage du jeune couple. Chacun se réjouit de cette fin heureuse (« Bravo, Bravo, Don Pasquale ! »)