Acte I

L'opéra s'ouvre dans l'église Sant'Andrea della Valle à Rome dans laquelle entre Cesare Angelotti, ancien consul de la république de Rome qui vient de s'échapper du Château Saint-Ange où il était prisonnier politique. Il se met en quête de la clef cachée par sa sœur, lui donnant accès à la chapelle familiale dans laquelle il se réfugie. Entre alors le sacristain qui s'étonne que le peintre Mario Cavaradossi ne soit pas en train de travailler sur son tableau représentant Marie-Madeleine, et qu'il n'ait pas entamé son repas. Le peintre entre et confirme au sacristain que le portrait est inspiré d'une femme venue prier récemment dans l'église, et qu'il n'a pas l'intension de toucher aux victuailles qui l'attendent.

Dès le sacristain parti, Angelotti sort de la chapelle et retrouve Cavaradossi, son ami, qui lui offre son repas et lui demande de retourner se cacher, son amante, Tosca, arrivant. Celle-ci l'ayant entendu parler avant son entrée, laisse apparaître son caractère jaloux et le soupçonne de lui cacher une autre femme. Le peintre l'apaise en lui promettant de la retrouver, le soir venu. Mais remarquant que le visage peint est inspiré de l'Attavanti, ses doutes reviennent. Elle n'accepte de partir que lorsque Cavaradossi lui promet de changer la couleur des yeux du portrait. Angelotti sort alors de sa cachette déguisé, sa sœur, la Marquise Attavanti, étant venu à plusieurs à l'église préparer sa fuite. Cavaradossi lui propose de se cacher chez lui et de l'accompagner car des coups de canon ont averti la ville qu'un prisonnier s'est échappé.

Le sacristain entre dans l'église vide pour annoncer la défaite de Napoléon puis arrive le baron Scarpia, chef de la police, qui est sur la trace d'Angelotti. Celui découvre la porte de la chapelle Attavanti ouverte avec le panier de victuailles vide, un éventail aux armes de la Marquise (sœur d'Angelotti) et le tableau la représentant. Lorsque Tosca entre pour annoncer à Cavaradossi qu'elle ne pourra le retrouver le soir, devant chanter au Palais Farnese pour célébrer la victoire sur Napoléon, Scarpia lui montre les objets retrouvés et insinue que la Marquise pourrait être la maîtresse de Cavaradossi. Furieuse, elle part, souhaitant démasquer son amant infidèle, suivie à son insu par des hommes de Scarpia, qu'elle mène jusqu'au lieu où le peintre a caché Angelotti. Scarpia se joint aux fidèles qui entonnent un Te Deum, se réjouissant d'exploiter ainsi la jalousie de Tosca, et se jurant de la posséder.

Acte II

Scarpia est dans ses appartements du Palais Farnese. Il écrit à Tosca pour lui demander de venir l'y retrouver après son tour de chant, mais est interrompu par ses hommes qui l'avertissent qu'ils n'ont pu trouver Angelotti, mais qu'ils ont arrêté Cavaradossi. Scarpia demande à ce qu'on le lui amène, afin de l'interroger. Celui-ci nie toute implication dans la fuite d'Angelotti. Lorsque Tosca arrive, Cavaradossi parvient à lui demander de ne rien dire de ce qu'elle sait, sous peine de le condamner. Il est ensuite emmené à l'écart pour être torturé, pendant que Scarpia interroge Tosca. Celle-ci, effondrée par les cris de douleur de son amant, finit par révéler la cachette d'Angelotti pour que la torture cesse. Cavaradossi reparaît, furieux que son amante l'ait trahi. Un agent annonce alors à Scarpia que c'est en fait Napoléon qui a remporté la victoire à Marengo. Furieux, celui-ci ordonne que Cavaradossi soit emmené au château Saint-Ange pour y être exécuté.

Tosca supplie Scarpia de libérer son amant, et cherche à l'apitoyer (« Vissi d'arte, vissi d'amore »). Celui-ci lui propose de libérer Cavaradossi après un simulacre d'exécution si elle se donne à lui. Elle accepte. Scarpia rédige alors un laissez-passer pour leur permettre de fuir et fait croire à Tosca qu'il donne des ordres pour que l'exécution ne soit que simulée. Dès les papiers obtenus, Tosca poignarde Scarpia et s'enfuit.

Acte III

Sur les remparts du château Saint-Ange, on entend au loin un petit berger chanter. Cavaradossi demande à écrire un message à son amante (« E lucevan le stelle »). Puis il est rejoint par Tosca qui lui explique qu'il doit faire semblant de tomber lorsque les soldats simuleront l'exécution. Elle va se cacher et observe la scène d'exécution, jugeant l'exécution bien imitée. Elle court retrouver son amant des les soldats partis, mais constate qu'il a réellement été exécuté. Au loin, la mort de Scarpia est découverte et les soldats viennent l'arrêter. Elle se jette alors du haut des remparts pour échapper à la capture.