Originaire de l'Illinois (États-Unis), Matthew Polenzani commence ses études à la Eastern Illinois University où il étudie avec la soprano Margaret Harshaw en 1990. Puis, il poursuit à la Yale School of Music avec Richard Cross et Doris Yarick-Croix, où il obtient un master.

En 1997, il fait sa première apparition au Metropolitan Opera de New-York, en Krouchtchev dans Boris Godounov de Moussorgski. En 1998, il est invité à l'Opéra de Bordeaux pour y jouer Gérald dans Lakmé de Léo Delibes. Il retourne dès 2000 au Metropolitan Opera (où il a déjà chanté dans près de 40 productions, y prenant de nombreux rôles) en Ténor italien dans Le Chevalier à la rose puis l'année suivante en David dans les Maîtres chanteurs de Nuremberg de Wagner. La même année, il délivre son unique prestation à La Monnaie, en Vania Koudriach dans Katia Kabanova. En 2004, le Met l'invite en Tamino dans La Flûte enchantée puis en Nemorino dans L’Élixir d'amour l'année suivante. En 2006, il fait sa première apparition sur la scène de l'Opéra Bastille de Paris, interprétant alors Edgardo dans Lucia di Lammermoor de Donizetti. Puis, en 2007, c'est Philadelphie qui lui offre le rôle du Duc de Mantoue dans Rigoletto. Fidèle au Met, il y interprète Belmonte dans L'Enlèvement au sérail de Mozart en 2008. La même année, il débute à La Scala en Alfredo dans La Traviata. Il y retourne en 2012 dans Manon de Massenet, mis en scène par Laurent Pelly et dirigé par Fabio Luisi. 

Durant l'année 2014, il se rend au Royal Opera House de Londres pour chanter le rôle titre d'Idoménée de Mozart, dans une nouvelle mise en scène de l'autrichien Martin Kusej, puis à Chicago dans le rôle-titre de La Clémence de Titus. En 2015, il participe au traditionnel concert du Nouvel an de la Fenice de Venise. Il interprète également le rôle-titre de Werther à Munich, ainsi que celui des Contes d'Hoffmann d'Offenbach au Met, où il retourne en 2015 en Nadir dans Les Pêcheurs de perles de Bizet. Le ténor interprète Rodolfo dans La Bohème de Puccini au Liceu en 2016. L'Opéra de Munich le reçoit ensuite en Fernand dans La Favorite de Donizetti. De retour au Met en 2019, il interprète Vaudemont dans Iolanta ainsi que Macduff dans Macbeth. Puis, il prend le rôle de Don José dans Carmen à San Francisco. Après de nombreuses annulations liées à la crise du Covid-19, il se déconfine depuis Madrid, avec La Traviata. 

En 2020/2021, Matthew Polenzani sera présent sur la scène de l’Opéra de Chicago pour l’Elixir d’Amour (Nemorino). De retour en mai au Met, il interprètera La Bohème en avril puis prendra le rôle de Captain Vere dans Billy Budd en mai. Enfin, il interprètera le rôle-titre d’Idoménée à l’Opéra d’Etat de Munich en juillet.