Nikolaus Harnoncourt est né à Berlin le 6 décembre 1929. Du côté paternel, il descend d’une grande famille lorraine, les de La Fontaine, qui servirent les Habsbourg, et du côté maternel de François Ier d’Autriche. En 1948, il commence à étudier la musique et le violoncelle à l’Académie de musique et d'arts du spectacle de Vienne. En 1952, il débute comme violoncelliste à l’Orchestre symphonique de Vienne. Déçu, il décide d’effectuer des recherches musicologiques approfondies qu’il complète par l’apprentissage de la viole de gambe, et commence une collection d’instruments baroques et de la Renaissance.

En 1953, avec sa femme, la violoniste Alice Hoffelner, il crée le Concentus Musicus Wien qui se spécialise dans la musique baroque jouée sur instruments d’époque et participe à populariser ce répertoire alors délaissé. En 1962, l’ensemble révolutionne l’interprétation et la compréhension de la musique baroque européenne avec leur enregistrement revisité des Concertos Brandebourgeois de Bach. En 1967, Nikolaus Harnoncourt gagne encore en notoriété en participant au film Chronique d’Anna Magdalena Bach, de Straub et Huillet, dans lequel il joue le Prince von Anhalt-Köthen. En 1971, accompagné de Gustav Leonhardt, il débute l’enregistrement de l’intégrale des Cantates de Bach. En 1975, il s’associe à Jean-Pierre Ponnelle pour un cycle consacré à Monteverdi à Zurich, puis le retrouve en 1980 pour un second dédié à Mozart.

Au fil du temps, Nikolaus Harnoncourt se crée une vaste discographie basée sur des collaborations prestigieuses. En 1981, il enregistre les Symphonies de Haydn, Mozart et Schubert avec l'Orchestre Royal du Concertgebouw d’Amsterdam. En 1985, il prend la direction du festival Styriarte de Graz. Puis en 1990 et 1991, il travaille avec l’Orchestre de chambre d’Europe pour les Symphonies de Beethoven et Mendelssohn. En 2001, l’enregistrement de La Passion selon Saint Matthieu de Bach reçoit l’éloge de la critique et un Grammy Award. La même année, le chef est invité pour la première fois à diriger le concert du nouvel an à Vienne, dont il reprend la direction en 2003. Cette même année, Harnoncourt dirige la première de La Grande-Duchesse de Gerolstein d'Offenbach au Festival de Styriarte où il prend aussi la direction de Carmen de Bizet en 2005. En 2008, il dirige la nouvelle production d’Idomeneo de Mozart à Graz, qui est acclamée par les médias nationaux et internationaux. Puis, en 2009, il dirige Porgy et Bess de Gershwin, toujours à Graz. Il y conduit aussi La Fiancée vendue de Smetana en 2011, le Stabat Mater de Pergolèse en 2012 et Barbe-Bleue d’Offenbach en 2013. Cette même année, il dirige aussi Fidelio de Beethoven au Théâtre de la Vienne où il revient en 2014 pour le triptyque de Mozart et Da Ponte : Les Noces de Figaro, Don Giovanni et Cosi fan tutte.

Le 5 décembre 2015, Nikolaus Harnoncourt annonce au public qu’il se retire du monde musical pour raisons de santé. Il décède le 5 mars 2016 à Sankt Georgen im Attergau en Autriche, laissant derrière lui de nombreux enregistrements de référence sur un répertoire étendu.